動物組織/細胞RNA提取試劑盒說明書
RNApure Tissue Kit
Cat. No. K0584
保存：室溫
組分說明
Cat. No. K0584
Kit Size 50
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 50
產品簡介
本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術與硅基質膜純化技術相結合，可從動物細胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般最多 30 mg 組織或 1 x 10 細7胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉錄和酶促反應后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質 RNA，幾乎無 DNA 殘留。如果要進行對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase I 在柱上進行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1） 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2） 玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3） 配制溶液應使用無RNase的水。
4） 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
2. 提取的樣品避免反復凍融，否則影響 RNA 提取的量和質量。
3. 使用前請檢查 Buffer RL 是否出現結晶或者沉淀，可置于 56℃加熱重新溶液。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，
至終濃度為 1%。如 1ml Buffer RL 加 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。
4. 第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. 所有離心步驟如無特殊說明均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。
6. 若下游實驗對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：YJ2090A）對 RNA 進行處理。
自備試劑： β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）
操作步驟
1. 樣品處理
1a. 組織：將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20 mg加350 μl Buffer RL。樣品體積不超過Buffer RL體積的十分之一。
1b 單層培養細胞：將細胞在培養瓶中直接裂解或處理成細胞懸液，離心得到細胞沉淀，棄上清，每6-10 cm2培養面積加入600 μl Buffer RL，小于6 cm2加入350 μl Buffer RL，反復吹打幾次，使其充分裂解。
1c. 細胞懸液：12,0006 rpm（～13,400×g）離心1分鐘棄上清，得到細胞沉淀。每5×10 6-1×107 細胞加入600 μl Buffer RL
注意：，少于1）盡量除盡5×10 細細胞加入胞培養350基， 細 μl胞培 Buffer養基可能抑制 RL，反復細胞的裂解影響吹打幾次，使其充分裂解。RNA產量。
2）盡量使細胞充分懸浮并充分裂解，否則影響RNA產量。
2. 樣品充分裂解后，室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復合物*分離。
3. 12000rpm離心2-5min，取上清進行下步操作。
4. 加入1倍體積（600 μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。
注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，不會影響后續實驗。
5. 將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱的最大載量為100 µg不要超載，否則會影響RNA的產量和純度。
6． 向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
可選步驟：如果要進行對微量DNA非常敏感的RNA實驗，則用以下步驟替代步驟6。
1）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2）配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1 U/μl），混勻，配制成終體積為80 μl 的DNase I混合液。
注意: 以上體系為按照我公司產品DNase I （K2090A）反應體系進行配置，應用其他公司產品請參考相應說明書。
3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
4）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
8. 重復步驟7。
9. 12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR 等）。
10. 將吸附柱置于一個新的無 RNase 離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入 30-50 μl
RNase-Free Water，室溫放置 1 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，收集 RNA 溶液，-70℃保存 RNA，防止降解。
注意：1）RNase-Free Wate體積不應小于30 μl，體積過小影響回收率。
2）如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟10。
3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟10。
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